na získanie vedecko-akademickej hodnosti philosophiae doctor

v odbore doktorandského štúdia: 15-03-9 genetika

Bratislava 2001

Dizertačná práca bola vypracovaná v rámci doktorandského štúdia na Katedre genetiky Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského v Bratislave

Predkladateľ: Mgr. Andrea Ševčovičová, Katedra genetiky Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského, Mlynská dolina B-1, 842 15 Bratislava

Školiteľ: Prof. RNDr. Daniel Vlček, DrSc., Katedra genetiky Prírodovedeckej fakulty Univerzity Komenského Bratislava

Oponenti:

Autoreferát bol rozoslaný: .......................................................................................

Obhajoba dizertačnej práce sa koná dňa..............................................o...............h

pred komisiou pre obhajobu dizertačnej práce v odbore doktorandského štúdia vymenovanou predsedom spoločnej odborovej komisie..........................................

15-03-9 genetika

špecializácia: genetika mikroorganizmov

na Prírodovedeckej fakulte UK, Mlynská dolina, 842 15 Bratislava,

v miestnosti č......................

S dizertačnou prácou sa môžete oboznámiť na Oddelení vedeckovýskumnej činnosti Dekanátu Prírodovedeckej fakulty UK v Bratislave, Mlynská dolina, pavilón B-2. Práca je v dostupná v elektronickej verzii na adrese: www.fns.uniba.sk/~sevcovicova

Prof. RNDr. Daniel Vlček, DrSc.

Predseda spoločnej odborovej komisie

Katedra genetiky

Prírodovedecká fakulta UK, Bratislava

1. Súčasný stav problematiky

1.1 Reparačné mechanizmy Chlamydomonas reinhardtii

Štúdium v oblasti reparačných mechanizmov fotoautotrofných organizmov nedosahuje úroveň poznatkov pri heterotrofoch. Doteraz je známych len málo presných informácií o enzymológii, biochémii a molekulárnej podstate proteínov a ďalších zložiek reparačných mechanizmov (Britt, 1996). Pri fotoautotrofných organizmoch sú riasy Chlamydomonas reinhardtii atraktívnym modelovým objektom pre štúdium opravy DNA.

Pri C. reinhardtii boli izolované reparačne deficitné mutanty, označené ako uvs mutanty (UV-sensitive), zatriedené do rôznych reparačných dráh na základe fenotypových charakteristík mutantných kmeňov a genetickej analýzy (Davies, 1967; Rosen a Ebersold, 1972; Small a Greimann, 1977a,b; Portney a Rosen, 1980; Small, 1987; Vlček et al., 1987; Podstavková et al., 1991; Podstavková et al., 1992; Vlček et al., 1997).

Pri C. reinhardtii sa po pôsobení UV žiarenia pozorovala účinná fotoreparácia jadrovej i chloroplastovej DNA (Small a Greinmann, 1977). Cox a Small (1985) izolovali mutantný kmeň phr1 s narušenou fotoreparáciou pyrimidínových dimérov jadrovej DNA, ale pri chloroplastovej DNA je efektívnosť podobná štandardnému typu. Zistilo sa tiež, že phr1 nie je mutáciou štruktúrneho génu pre DNA fotolyázu, ale ide pravdepodobne o mutáciu regulačného génu tohto enzýmu (Small, 1993). Petersen et al. (1999) izolovali gén PHR2, ktorý kóduje DNA fotolyázu triedy II. Nesie signálnu sekvenciu pre lokalizáciu v chloroplaste a predpokladá sa, že ide o DNA fotolyázu funkčnú v chloroplaste (Petersen et al., 1999).

Pri C. reinhardtii nebola zistená prítomnosť alkyltransferázy (Frost a Small, 1987). Doteraz pri riasach nie je známy žiaden špecifický spôsob opravy poškodení DNA indukovaných alkylačnými látkami a ani inými chemickými látkami. Najcitlivejšími na pôsobenie týchto látok sa javia mutanty s poruchou v rekombinačnej oprave, čo naznačuje, že pri riasach tento typ opravy hrá dôležitú úlohu v odstraňovaní poškodení spôsobených chemomutagénmi (Miadoková et al., 1994).

Hoci prvé pokusy pri riasach naznačili, že excízna oprava pri C. reinhardtii neprebieha (Swinton a Hanawalt, 1973), Small a Greimannová (1977a) modifikovali metodiku detekcie pyrimidínových dimérov a analýzy DNA po ovplyvnení UV žiarením a dokázali prítomnosť excíznej opravy pri štandardnom kmeni C. reinhardtii v jadrovej i mimojadrovej DNA (Small a Greimann, 1977). Davies (1967) izoloval mutanta uvs1, pri ktorom bola dokázaná úplná strata excízne opravy, čím sa potvrdila existencia mutantov tohto typu aj pri zelených riasach (Small, 1987). Z týchto pokusov súčasne vyplynulo, že v chloroplastovej DNA sú diméry odstraňované excíziou pri štandardnom type aj pri uvs1 kmeni, čo naznačuje nezávislú kontrolu tohto opravného systému v jadrovej a chloroplastovej DNA (Small a Greimann, 1987). Medzi excízne-deficitné mutanty ďalej patria kmene uvs6 (Davies, 1967), uvs9 (Small, 1987), uvs12 a uvs15 (Podstavková et al., 1992; Miadoková et al., 1995; Vlček et al., 1997).

Pri fotoautotrofných organizmoch doteraz nebola potvrdená existencia opravy chybne spárovaných báz (Britt, 1996). Pri riasach C. reinhardtii bol izolovaný mutantný kmeň uvs14, pri ktorom bola zistená zvýšená hladina spontánnej aj indukovanej mutability (Vlček et al., 1997). Tieto výsledky naznačili, že pri tomto kmeni by mohlo ísť o poruchu "mismatch" korekcie, avšak jednoznačný dôkaz v súčasnosti ešte nie je k dispozícii.

Pri C. reinhardtii boli tiež získané kmene, pri ktorých sa predpokladá narušený rekombinačný reparačný mechanizmus - uvsE1, uvsE5, uvsE6 a uvs10 (Rosen a Ebersold, 1972; Vlček et al., 1987). Vyššia citlivosť dvojitých mutantov (uvsE1uvsE5, uvsE1uvsE6, uvsE5uvsE6) v porovnaní s jednoduchými mutantami naznačuje, že ide o narušenie rozdielnych subdráh rekombinančnej opravy.

Niektoré gény zapojené do opravy DNA boli na základe klasických genetických metód mapované a charakterizované (Davies, 1967; Vlček et al., 1981; Vlček et al., 1987; Podstavková et al., 1991; Vlček et al., 1991; Podstavková et al., 1992; Miadoková et al., 1994; Vlček et al., 1997). Avšak dodnes nie sú známe produkty týchto génov a taktiež ich presná funkcia v procese opravy DNA. Jednou z metód, ktorá by mohla prispieť k rýchlejšiemu napredovaniu výskumu v oblasti reparačných mechanizmov pri fotoautotrofných organizmoch na príklade jednobunkovej zelenej riasy C. reinhardtii, je úspešná transformácia jadrového genómu.

1.2 Zastavenie bunkového cyklu ako odpoveď na poškodenie DNA

Prítomnosť DNA poškodení alebo tiež aj nezreplikovanej DNA môže spôsobiť dočasné zastavenie bunkového cyklu (Murray, 1992; Weinert a Lydall, 1993), ktoré zabezpečí pre bunku čas potrebný na opravu poškodenia a dokončenie krokov potrebných na prechod z jednej fázy bunkového cyklu do druhej a zvýši tak pravdepodobnosť prežitia bunky (Fasullo et al., 1998). K zastaveniu bunkového cyklu dochádza v určitých bodoch, ktoré sa označujú ako kontrolné body bunkového cyklu, ktoré kontrolujú vstup do S a M fázy predlžujúc G1 a G2 fázu pre opravu DNA (Weinert a Hartwell, 1988; Hartwell a Weinert, 1990).

Jednu z kľúčových úloh v zastavení bunkového cyklu v prítomnosti DNA poškodenia pri kvasinkách zohráva produkt génu RAD9 (Siede et al., 1993). Úloha RAD9 ako kontrolného bodu sa sledovala na základe porovnania fenotypu rad9 mutantov s bunkami štandardného typu. Ak neboli bunky rad9 ožiarené, dĺžka bunkového cyklu ani prežívanie rad9 mutanta sa nelíšilo od štandardného kmeňa. Jediným známym fenotypom rad9 mutantov je to, že v bunkách rad9 častejšie dochádza k spontánnym stratám chromozómov. V bunkách kvasiniek a cicavcov je frekvencia straty chromozómov menej ako 10^-5 na jedno bunkové delenie. Pri rad9 mutantoch sa táto frekvencia zvyšuje 7-21 -krát (Weinert a Hartwell, 1990). Ak boli bunky ovplyvnené X-žiarením, bunky štandardného kmeňa zastavili bunkový cyklus v G2 fáze, zatiaľčo bunky rad9 mutanta pokračovali v delení bez zastavenia a po niekoľkých deleniach odumreli (Weinert a Hartwell, 1988; Hartwell a Weinert, 1989). Mutanty rad9 inkubovaníé istý čas po ovplyvnení X-žiarením v médiu obsahujúcom mikrotubulový jed vykazovali prežívanie na úrovni štandardného kmeňa (Weinert a Hartwell, 1989). Toto pozorovanie naznačilo, že RAD9 gén nie je priamo zahrnutý v oprave DNA, ale skôr pôsobí ako kontrolný bod, ktorý v prítomnosti DNA poškodení v bunke dokáže zastaviť bunkový cyklus a získať čas potrebný na opravu poškodení DNA alebo dokončenie replikácie.

1.3 Mutanty s predpokladanou poruchou zastavenia bunkového cyklu ako odpovede na poškodenie DNA pri C. reinhardtii

Prvým mutantom, ktorý naznačil možný vzájomný vzťah medzi poškodením DNA a reguláciou bunkového cyklu pri riasach, bol mutant uvr1, ktorý vykazuje zvýšenú rezistenciu voči UV-žiareniu v porovnaní so štandardným kmeňom. Pri štúdiu tohto mutanta sa zistilo, že k zvýšenej rezistencii voči UV-žiareniu by mohlo dochádzať následkom predĺženia bunkového cyklu oproti dĺžke bunkového cyklu pri štandardnom kmeni. Toto predĺženie sa prejavovalo posunom začiatku a ukončenia syntézy DNA, karyokinézy, zväčšovania objemov a počtu uvoľnených dcérskych buniek (zoospór) z pôvodných materských (Vlček et al., 1981). Takéto predĺženie by pre bunku znamenalo získanie času na opravu poškodení indukovaných UV-žiarením.

Pri C. reinhardtii sa izoloval aj kmeň uvs11, pri ktorom sa v porovnaní so štandardným typom zistila zvýšená citlivosť na UV-žiarenie, MNNG a takisto aj zvýšená frekvencia priamych mutácií vedúcich k re­zistencii na streptomycín (Vlček et al., 1987; Miadoková et al., 1994). Bunky mutantného kmeňa uvs11 ovplyvnené mutagénom (UV, MNNG) sa rozdelia pred odumretím minimálne jedenkrát, následkom čoho vznikajú mikrokolónie s neživotaschopnými bunkami (Vlček et al., 1987). Podstata poruchy mutácie uvs11 zatiaľ nie je známa, avšak doterajšie výsledky (fenotypový prejav po pô­sobení UV-žiarenia a MNNG, tvorba mikrokolónií) naznačujú, že ide o mutáciu v géne sprostredkujúcom prepojenie medzi poškodením DNA a reguláciou bunkového cyklu, podobne ako pri mutantnom kmeni rad9 v kvasinkách S. cerevisiae.

2. Ciele dizertačnej práce

Cieľom dizertačnej práce bolo na základe molekulárnej, mutačnej a genetickej analýzy prispieť k rozšíreniu zbierky charakterizovaných mutantov C. reinhardtii ako základného predpokladu pre štúdium a pochopenie reparačných procesov fotoautotrofných organizmov. Pri analýze mutantov sme sa zamerali na nasledovné otázky:

• Sledovať fenotypový prejav reparačne-deficitných mutantov C. reinhardtii po pôsobení fyzikálnych a chemických agensov (X-žiarenia a MNNG).

• Urobiť genetickú analýzu kmeňov s poruchou v excíznej oprave na určenie alelizmu mutantov.

• Pomocou molekulárnej analýzy sledovať excíziu pyrimidínových dimérov pri mutantoch zbierky.

• Zistiť, či reparačno-deficitné kmene patria do skupiny, do ktorej boli predbežne zaradené.

• Zistiť pravdepodobnú úlohu UVS11 génu v regulácii bunkového cyklu a jeho vplyv na opravné procesy v bunke.

• Sledovať možnú analógiu funkcie RAD9 génu pri kvasinkách a UVS11 génu pri riasach.

• Uskutočniť transformáciu jadrového genómu C. reinhardtii.

3. Zvolené metódy spracovania

Pri štúdiu reparačných systémov zbierky mutantov jednobunkovej zelenej riasy C. reinhardtii sme použili genetické, molekulárno-biologické a cytologické metodické postupy.

Fenotypovú charakteristiku mutantných kmeňov sme robili hodnotením kriviek prežívania po ovplyvnení MNNG a X-žiarením. Pre určenie vzťahu medzi porušeným reparačným systémom a mutagenézou po pôsobení MNNG a X-žiarenia sme sledovali frekvenciu priamych mutácií vedúcich k rezistencii na streptomycín. Pri genetickej analýze sme použili techniky hybridizácie mutantných kmeňov (určenie typu dedičnosti, určenie alelizmu mutantných génov). Molekulárno-genetickú analýzu poruchy opravy DNA v podmienkach zabraňujúcich fotoreaktivácii (vyštiepovania pyrimidínových dimérov z DNA po pôsobení UV-žiarenia) sme robili značením DNA rádioaktívnymi prekurzormi, jej štiepením UV-dimér špecifickou endonukleázou, separovaním frakcií DNA s nízkou a vysokou molekulárnou hmotnosťou centrifugáciou v sacharózovom gradiente a vyhodnotením vzoriek pomocou scintilačného počítača.

Cieľom práce bolo prispieť k štúdiu opravných mechanizmov C. reinhardtii pomocou molekulárnej, mutačnej a genetickej analýzy UV-citlivých mutantov izolovaných na Katedre genetiky PvF UK.

Prvú informáciu o reparačne-deficitných mutantoch poskytuje porovnanie ich kriviek prežívania s prežívaním buniek štandardného kmeňa po pôsobení rôznych mutagénov, či už fyzikálnych (X-žiarenie, UV-žiarenie) alebo chemických (MNNG). Prežívanie buniek závisí od ich citlivosti k danému agensu.

Z porovnania kriviek prežívania po pôsobení MNNG vyplýva, že všetky testované kmene sú citlivejšie v porovnaní so štandardným typom, čo naznačuje, že tieto kmene majú zníženú schopnosť odstraňovať poruchy spôsobené chemomutagénmi typu MNNG. Ako najcitlivejší sa javil kmeň uvs15, s predpokladanou poruchou mutagénneho reparačného mechanizmu, a kmeň uvsE1, pri ktorom bola zistená porucha v rekombinačnej oprave (Rosen a Ebersold, 1972).

Pri hodnotení mutability po pôsobení MNNG sme zistili opačný jav v porovnaní so zisteniami získanými pri S. cerevisiae, pri ktorých pri excíznych kmeňoch po pôsobení alkylačných látok zvyčajne dochádza k zvýšeniu frekvencie výskytu mutácií (Haynes a Kunz, 1981). Excízna oprava je pri kvasinkách "error-free", t.j. presná a jej porucha teda navodzuje zvýšenú mutabilitu. V prípade excízne-deficitných kmeňov C. reinhardtii (uvs9 a uvs15) došlo k zníženému výskytu mutácií v porovnaní so štandardným kmeňom, čo by mohlo znamenať, že pri riasach excízna oprava nie je presná. Toto tvrdenie by však bolo potrebné doplniť o ďalšie experimentálne dôkazy.

Pri riasach ešte nie je definovaný mechanizmus, ktorý by sa podieľal na oprave poškodení vyvolaných alkylačnými látkami. Na základe porovnania výsledkov získaných sledovaním prežívania po pôsobení UV žiarenia a MNNG, možno predpokladať, že zatiaľ čo na oprave porúch spôsobených UV-žiarením sa podieľa excízny reparačný mechanizmus, o čom svedčí vysoká citlivosť kmeňa uvs9 (Podstavková et al., 1991), na oprave porúch spôsobených chemomutagénmi typu MNNG bude mať pravdepodobne dôležitejšiu úlohu iný opravný systém, resp. systémy. Výsledky získané v tejto práci naznačili vysokú citlivosť kmeňa s poruchou rekombinačnej reparácie, čo by znamenalo, že pri riasach by mohol zohrávať dôležitú úlohu pri oprave poškodení spôsobených MNNG práve rekombinačný reparačný systém. Nemožno však vylúčiť ani spoluúčasť iného, ešte neopísaného reparačného systému, pretože aj pri kvasinkách a baktériach sa na oprave poškodení spôsobených alkylačnými látkami zúčastňujú viaceré reparačné dráhy (Friedberg et al., 1995).

Pri hodnotení vplyvu X-žiarenia sme zistili, že najcitlivejšími kmeňmi sú kmene s poruchou rekombinačného reparačného mechanizmu a kmeň uvs15 s predpokladanou poruchou mutagénnej opravy. Kmeň uvs12, s poruchou excízneho mechanizmu opravy DNA, bol menej citlivý k pôsobeniu X-žiarenia v porovnaní so štandardným kmeňom. Nízka citlivosť v porovnaní so štandardným kmeňon sa zistila aj pri excízne-deficitnom kmeni uvs1 (Chankova et al., 1994), čo naznačuje, že tento systém opravy nezohráva významnú úlohu pri odstraňovaní poškodení spôsobených X-žiarením.

Na základe našich experimentov môžeme predpokladať, že pri riasach C. reinhardtii takisto dochádza k spolupráci, resp. súťaženiu viacerých reparačných mechanizmov pri oprave poškodení indukovaných MNNG alebo X-žiarením. Podobne je tomu pri kvasinkách S. cerevisiae, pri ktorých sa štúdiom trojitých mutantov, s mutáciou génu z každej epistatickej skupiny, zistil významný podiel všetkých troch epistatických skupín na oprave poškodení indukovaných X-žiarením (Game, 2000). Takto sa získal ďalší dôkaz o tom, že niektoré druhy poškodení môžu byť opravované viacerými reparačnými mechanizmami.

Získaním charakteristiky vybraných mutantov sa nám podarilo doplniť niektoré informácie o reparačných mechanizmoch pri fotoautotrofných organizmoch. Do roku 1997 nebol pri fotoautotrofných organizmoch izolovaný mutant s poruchou mutagénnej opravy ani mismatch korekcie. V tejto súvislosti sa ako zaujímavý javí kmeň uvs14, ktorý so zvýšenou spontánnou a indukovanou mutabilitou a rovnako aj rezistenciou k poškodeniu po pôsobení alkylačnch látok, vykazuje typické znaky mutantov s narušenou "long patch mismatch" korekciou (Modrich, 1991). Nemenej zaujímavý je kmeň uvs15, ktorý nemutoval po UV a X-žiarení, veľmi málo po MNNG a patrí k najcitlivejším kmeňom po pôsobení všetkých testovaných mutagénov. Tento kmeň vykazuje podobnosť s rad6 mutantom S. cerevisiae s rozhodujúcou úlohou v mutagénnej epistatickej skupine (Haynes a Kunz, 1981). Na rozdiel od rad6, pri uvs15 je súčasne narušený aj excízny systém opravy. To je zaujímavý fakt, lebo mutanty s narušenou excíznou opravou majú pri kvasinkách obyčajne zvýšenú mutabilitu (Haynes a Kunz, 1981), pri riasach tomu tak však nie je. Genetická analýza potvrdila, že ide o poruchu v jednom géne, pri ktorom sa predpokladá, že má pleiotropný účinok alebo sprostredkuje prekrývanie funkcií medzi reparačnými cestami alebo interaguje s inými reparačnými proteínmi pri utváraní reparačných komplexov (Vlček et al., 1997). Takýto mutant ešte pri heterotrofných organizmoch nebol opísaný.

Najvhodnejšou metódou na zatriedenie reparačne-deficitných kmeňov do jednotlivých reparačných dráh je molekulárna analýza. V našej práci sme použili enzymatickú metódu podľa Small a Greimann (1977a) na zistenie, či reparačne-deficitné kmene majú narušený excízny mechanizmus opravy. Rádioaktívne značenú DNA sme po ovplyvnení UV žiarením izolovali a miesta pyrimidínových dimérov sme detekovali pomocou UV-špecifickej endonukleázy z Micrococcus luteus, ktorá je po detailnejšom preskúmaní svojej aktivity v súčasnosti označovaná ako UV-dimér špecifická glykozyláza/AP lyáza (Mlu-pdgI) (Lloyd, 1998). Po izolácii, štiepení a centrifugácii DNA v sacharózovom gradiente sme merali množstvo DNA v jednotlivých frakciách. Ako negatívnu kontrolu sme použili štandardný kmeň W1, ktorý nemá porušenú excíznu opravu. Pri tomto kmeni očividne došlo k odstráneniu pyrimidínových dimérov po 24-hodinovej kultivácii v tme, čo opätovne potvrdzuje už dokázaný fakt, že C. reinhardtii má funkčnú excíznu reparačnú dráhu. Ako pozitívnu kontrolu sme použili excízne defektný kmeň uvs9, pri ktorom ani po 24 hodinách nedochádza k obnoveniu vysokomolekulárnych frakcií a teda k vyštiepeniu pyrimidínových dimérov.

Molekulárna analýza reparačne-deficitných kmeňov potvrdila poruchu vo vyštiepovaní pyrimidínových dimérov pri mutantoch uvs12 a uvs15. Naopak pri kmeňoch uvs13 a uvs14 nebola zistená porucha vo vyštiepovaní pyrimidínových dimérov, čím sme potvrdili, že tieto mutanty nepatria do skupiny mutantov s poruchou excíznej reparačnej dráhy.

V rámci genetickej analýzy sme určovali alelizmus mutantných kmeňov s predpokladanou poruchou excíznej reparačnej dráhy. Na základe genetickej analýzy sme dokázali vyštiepovanie štandardného typu pri väčšine krížení, čo potvrdilo, že sledované gény nie sú alelické. Výnimkou boli kríženia uvs1 x uvs371 a uvs9 x uvs351, pri ktorých sme ani pomocou analýzy na úrovni zygót nepotvrdili obnovenie štandardného fenotypu. Na základe získaných výsledkov môžme uvažovať, že v tejto skupine mutantov ide o 4 samostatné gény určujúce citlivosť k UV žiareniu.

V zbierke reparačne-deficitných mutantov C. reinhardtii sa nachádzajú aj také kmene, ktoré na základe fenotypovej charakteristiky naznačili možné prepojenie medzi poškodením DNA a reguláciou bunkového cyklu. Jedným z nich je aj kmeň uvs11 (Vlček et al., 1987). Podstata poruchy mutácie uvs11 zatiaľ nie je známa, avšak na základe doterajších výsledkov (fenotypový prejav po pô­sobení UV-žiarenia a MNNG, tvorba mikrokolónií) môžme predpokladať jej podobnosť s rad9 mutáciou v kvasinkách S. cerevisiae. Keďže v literatúre je málo zmienok o porovnaní základných bunkových procesov medzi heterotrofnými a fotoautotrofnými mikroorganizmami, cieľom našej práce bolo práve hľadanie možných spoločných znakov medzi spomenutými mutantami.

V našich experimentoch sme pozorovali zvýšenú citlivosť oboch sledovaných mutantov po pôsobení UV, X-žiarenia aj MMS. Zastavenie bunkového cyklu pomocou MBC viedlo k zlepšeniu prežívania pri oboch mutantoch, pričom pri mutantnom kmeni uvs11 sa prežívanie zlepšilo až na úroveň štandardného typu po pôsobení UV aj X-žiarenia. Prežívanie uvs11 mutanta, so zablokovaným bunkovým cyklom pomocou MBC, sa zlepšilo aj po pôsobení MMS, avšak nevrátilo sa až na úroveň štandardného kmeňa ako tomu bolo pri UV a X-žiarení.

MBC po zastavení bunkového cyklu poskytne čas pre opravu DNA, ktorá je znemožnená pri poruche bunkového cyklu, čo sa potvrdilo aj pri mikroskopickom pozorovaní buniek po ovplyvnení ionizujúcim žiarením. Pri riasach C. reinhardtii je ukazujúcim znakom v tomto prípade pomer množstva buniek odumretých pred delením a po delení bunky. Mikrokolónie mŕtvych buniek sú pri C. reinhardtii veľmi dobre hodnotiteľné svetelným mikroskopom. Bunky uvs11 mutanta vytvárajú mikrokolónie po ovplyvnení UV, X- žiarením aj MMS s oveľa vyššou frekvenciou ako bunky štandardného kmeňa. Po ovplyvnení MBC sa podiel buniek odumierajúcich po delení pri mutantnom kmeni uvs11 rádovo znížil, rovnako ako pri rad9 kmeni S. cerevisiae (Weinert a Hartwell, 1988; Weinert a Hartwell, 1990).

Z prezentovaných výsledkov je možné predpokladať analógiu UVS11 génu C. reinhardtii s kvasinkovým RAD9 génom. Správnosť našich predpokladov môžme overiť, resp. vyvrátiť, komplementáciou defektu uvs11 mutanta funkčným RAD9 génom. Nevyhnutnou podmienkou je však zavedenie metódy pre úspešnú transformáciu jadrového genómu pri C. reinhardtii. Transformačná technika je v súčasnosti bežne využívaná v takmer každom genetickom a molekulárnom výskume a na rôznych modelových organizmoch, od baktérií až po eukaryotické rastlinné a živočíšne druhy.

Doteraz boli vyvinuté tri rôzne metódy na transformáciu C. reinhardtii - bombardovanie buniek wolfrámovými partikulami, elektroporácia a transformácia pomocou sklených guličiek a polyetylénglykolu (PEG). Keďže prvé dve spomínané metódy vyžadujú špeciálne (finančne nákladné) technické vybavenie, rozhodli sme sa na zavedenie DNA do buniek C. reinhardtii využiť metódu využívajúcu sklené guličky a PEG. Tranformovali sme kmene deficietné v syntéze arginínu, ktorých defekt je komplementovaný génom arg7.8 nachádzajúcim sa na plazmide.

Nami zvolená metóda si vyžaduje prácu s bunkami bez bunkovej steny. Neprítomnosť bunkovej steny možno zabezpečiť dvoma spôsobmi - použitím genetického mutanta alebo odstránením bunkovej steny pomocou gametického lytického enzýmu autolyzínu. V prvom prípade ide o kmeň cw15, ktorému chýba centrálny triplet - vrsty V2 až V6 bunkovej steny (Harris, 1989). Pri kmeňoch s intaktnou bunkovou stenou (v našom prípade cc51, ktorý nesie arg7 mutáciu) sme bunkovú stenu natrávili autolyzínom a ihneď transformovali. Izolácia a použitie autolyzínu je veľmi jednoduché a pritom účinné. Možno ho použiť aj pri iných metódach, ktoré tiež vyžadujú odstránenie pevnej bunkovej steny rias, napr. pri metóde pulznej gélovej elektroforézy.

S takto pripravenými kmeňmi (bez bunkovej steny) sme uskutočnili transformáciu jadrového genómu jednobunkovej zelenej riasy C. reinhardtii. Zistili sme, že na účinnosť transformácie vplýva viacero parametrov: čistota plazmidovej DNA, koncentrácia a molekulová hmotnosť polyetylénglykolu, genotyp recipientného kmeňa, čas ovplyvnenia.

V súčasnosti je pri riasach pripravený dvojitý mutant uvs11 arg7.8. Tento kmeň bude možné použiť na komplementáciu uvs11 mutácie RAD9 génom. Existencia genómovej a cDNA knižnice by tiež umožnila izolovať nielen UVS11, ale aj ďalšie gény pomocou komplementácie jednotlivých mutantných fenotypov. V súčasnosti sú k dispozícii genómové knižnice v kozmidoch a kvasinkových umelých chromozómoch (YAC), cDNA knižnica v l fágu a tzv. indexová kozmidová knižnica (Purton a Rochaix, 1994; Zhang et al., 1994; Infante et al., 1995). Podmienkou však zostáva vysoká transformačná účinnosť, ktorá sa pri riasach C. reinhardtii od počiatku výskumov v tejto oblasti zvýšila, ale stále nedosahuje úroveň frekvencie transformácie pri iných organizmoch (napr. E.coli a kvasiniek).

Štúdium v oblasti reparačných mechanizmov DNA pri jednobunkovej zelenej riase C. reinhardtii neustále napreduje. Pomocou metód molekulárnej biológie aplikovaných na tento modelový organizmus bude v budúcnosti možné zistiť produkty už mapovaných a charakterizovaných génov a taktiež ich presnú funkciu v procese opravy DNA.

5. Závery

• Porovnaním prežívania testovaných mutantov a štandardného kmeňa po pôsobení MNNG sme zistili, že všetky testované reparačne-deficitné kmene sú citlivejšie na pôsobenie MNNG v porovnaní so štandardným kmeňom. Zvýšená citlivosť k MNNG pri kmeni uvsE1 s poruchou rekombinačnej reparačnej dráhy naznačila, že rekombinačný reparačný mechanizmus hrá úlohu pri oprave porúch spôobených týmto alkylačným agensom. Pri kmeňoch uvs9 a uvs15, s poruchou excíznej opravy, sme zistli zníženú frekvenciu mutácií indukovaných MNNG v porovnaní so štandardným kmeňom. Pozorované zníženie mutability týchto kmeňov naznačuje čiastočnú odlišnosť vo vzťahu k presnosti opravy po pôsobení MNNG medzi fotoautotrofnými a heterotrofnými organizmami.

• Porovnaním prežívania testovaných mutantov a štandardného kmeňa po pôsobení X-žiarenia sme zistili, že väčšina testovaných reparačne-deficitných mutantov je citlivejšia na pôsobenie X-žiarenia ako štandardný kmeň. Výnimku tvorí len kmeň uvs12 s poruchou excíznej reparačnej dráhy. Znížené prežívanie a zvýšenie frekvencie mutácií po pôsobení X-žiarenia oproti štandardnému kmeňu pri kmeňoch uvsE1 a uvs10 naznačuje, že pri riasach C. reinhardtii hrá rekombinačná reparačná dráha dôležitú úlohu pri odstraňovaní poškodení indukovaných X- žiarením a že táto reparačná dráha je presná. Kmeň uvs14, pri ktorom sme zistili zvýšenú spontánnu aj indukovanú mutabilitu po X-žiarení, vykazuje znaky mutantov s narušenou "mismatch" korekciou. Kmeň uvs15 patrí k najcitlivejším testovaným kmeňom, s veľmi nízkou (po pôsobení MNNG) alebo žiadnou (po pôsobení X-žiarenia) indukovanou mutabilitou. Tento kmeň vykazuje podobnosť s rad6 mutantom S. cerevisiae s rozhodujúcou úlohou v mutagénnej epistatickej skupine.

• Molekulárna analýza potvrdila poruchu vo vyštiepovaní pyrimidínových dimérov pri kmeňoch uvs15 a uvs12, čo znamená, že ide o mutantov s poruchou excíznej opravy. Pri kmeňoch uvs13 a uvs14 nebola potvrdená porucha vo vyštiepovaní pyrimidínových dimérov. Tým sme získali dôkaz, že mutantné kmene uvs13 a uvs14 nepatria do excíznej reparačnej dráhy.

• Výsledky molekulárnej a mutačnej analýzy naznačili, že pri kmeni uvs15 by mohlo ísť o mutáciu v géne s pleiotropným účinkom.

• Z výsledkov genetickej analýzy vyplýva, že v rámci skupiny analyzovaných mutantov excíznej reparačnej dráhy ide pravdepodobne o 4 rôzne gény určujúce citlivosť k UV žiareniu.

• Dokázali sme zvýšenú citlivosť uvs11 mutanta C. reinhardtii a rad9 mutanta S. cerevisiae na pôsobenie UV- a X- žiarenia a MMS. Potvrdili sme, že zastavenie bunkového cyklu pomocou MBC vedie k zvýšeniu prežívania pri rad9 kmeni kvasiniek S. cerevisiae a takisto aj pri uvs11 kmeni rias C. reinhardtii po pôsobení UV, X-žiarenia a MMS. Na základe kvantitatívneho určenia pomeru buniek odumierajúcich pred delením a po rozdelení pri C. reinhardtii sme dokázali, že zastavenie bunkového cyklu pomocou MBC vedie, analogicky s kvasinkami, k zníženiu počtu mikrokolónii.

• Uskutočnili sme transformáciu jadrového genómu mutantov cw15arg7.8 a cc51 C. reinhardtii plazmidom pARG7.8 nesúcim funkčný gén pre arginínsukcinátlyázu metódou využívajúcou sklené guličky a PEG. Dosiahli sme účinnosť transformácie v rozmedzí 0,35 x 10 ^-6 až 15,9 x 10 ^-6 pri kmeni cw15arg7.8 a 0,12x10 ^-6 až 1,16 x 10 ^-6 pri kmeni cc51. Zistili sme, že na účinnosť transformácie vplýva viacero parametrov: čistota plazmidovej DNA, koncentrácia a molekulová hmotnosť polyetylénglykolu, genotyp recipientného kmeňa, čas ovplyvnenia.

6. Zoznam citovanej literatúry

Britt, A.B., Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 47, 1996, 75-100.

Chankova, S.G. et al,, Biologia Plantarum, 36, 1994, 583 - 589.

Cox, J.L., Small, G.D., . Mutation Res., 149, 1985, 249-255.

Davies, D. R., Mutation Res., 4, 1967, 765-770.

Fasullo, M.T., Bennett, P., Ahching, P., Koudelik, J., Mol. Cell. Biol., 18, 1998, 1190-1200.

Friedberg, E.C., Walker, G.C., Siede, W.: DNA Repair and mutagenesis, ASM Press, Washington, 1995.

Frost, B. F., Small D. D., Mutation Res., 181, 1987, 37-44.

Game, J.C., Mutat Res., 451, 2000, 277-293.

Harris, E. H.: The Chlamydomonas reinhardtii sourcebook, Academic Press, San Diego,

California, 1989.

Hartwell, L.H., Weinert, T.A., Science, 246, 1989, 629-634.

Haynes, R.H., Kunz, B.A., in: The molecular biology of the yeast Saccharomyces cerevisiae.

Life cycle and inheritance. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1981, 371-414.

Infante, A., Shelly, L., Hall., J.L., Genetics, 141, 1995, 87-93.

Lloyd, R.S.: Mutation Res., 408, 1998, 159-170

Miadoková, E., Podstavková, S., Cervenák, Z., Vlček, D., Biologia, 49, 1994, 633-637.

Miadoková, E., Podstavková, S., Vlček, D., Algol. Studies, 79, 1995, 109-117.

Modrich, P., Ann. Rev. Genet., 25, 1991, 229-253.

Murray, A.W., Nature, 359, 1992, 599-604.

Petersen, J.L., Lang, D., Small, G.D., Plant. Mol. Biol., 40, 1999, 1063-1071.

Podstavková, S., Miadoková E., Vlček D., Arch. Protistenkd., 139, 1991, 201-206.

Podstavková, S., Vlček D., Miadoková, E., Mutation Res., 293, 1992, 65-69.

Portney, M. D., Rosen, H., Mutat. Res., 70, 1980, 311-321.

Purton, S.P., Rochaix, J.D., Plant Mol. Biol., 24, 1994, 663-672.

Rosen, H., Ebersold, W. T., Genetics, 71, 1972, 247-253.

Small, G. D., Mutation Res., 181, 1987, 31-35.

Small, G.D., Proceedings: Biology and Taxonomy of Green Algae II, 1993, p. 70.

Small, G. D., Greimann, C. S., Photobiol., 25, 1977, 183-187.

Small, G. D., Greimann, C. S., Nucleic Acid Research, 4, 1977, 1893-2902.

Swinton, D. C., Hanawalt, P. C., Photobiol., 17, 1973, 361-375.

Vlček, D., Podstavková, S., Miadoková, E., Biologia plantarum, 23, 1981, 427-433.

Vlček, D., Miadoková, E., Podstavková, S., Adams, G. M. W., Small, G. D.,

Mutation Res., 183, 1987, 169-175.

Vlček, D., Podstavková, S., Miadoková, E., Vlčková, V., Arch. Protistenkd. 139,

1991, 193-199.

Vlček, D., Podstavková, S., Miadoková, E., Mutation Res., 336, 1995, 251-256.

Vlček, D., Slivková, A., Podstavková, S., Miadoková, Mutation Res., 285, 1997, 243-249.

Weinert, T.A., Hartwell, L.H., Science, 241, 1988, 317-322.

Weinert, T.A., Hartwell, L.H., Mol. Cell. Biol., 10, 1990, 6554-6564.

Weinert, T.A., Hartwell, L.H., Genetics, 134, 1993, 63-80.

Zhang, H., Herman, P.L., Weeks, D.P., Plant Mol. Biol., 24, 1994, 663-672.

7. Pôvodné práce dizertanta vzťahujúce sa k danej problematike

7.1 Zoznam publikácií

Podstavková, S., Vlček, D., Miadoková, E., Slivková, A.: The localization of Chlamydomonas reinhardtii repair genes. Arch. Hydrobiol.- Algol. Stud., 82, 1996, 97-102.

Slivková, A., Podstavková, S., Miadoková, E.: A Chlamydomonas reinhardtii UV-sensitive mutant uvs15 is impaired in a gene involved in several repair pathways. Mutation Research, 385, 243-249, 1997.

Miadoková, E., Vlček, D., Slivková, A., Podstavková, S.: Algae as bioactivation system for promutagens. Biologia, 53/4: 583 - 586, 1998.

Slivková, A., Miadoková, E., Podstavková, S., Vlček, D.: Responses oc Chlamydomonas reinhardtii repair-deficient strains to X-ray irradiation. Biologia, 53/4: 587-589, 1998.

Slaninová, M., Ševčovičová, A., Nagyová, B., Miadoková, E., Vlčková, V., Vlček, D.: Chlamydomonas reinhardtii UVS11 gene is required for cell cycle arrest in response to DNA damage. Arch. Hydrobiol.- Algol. Stud - zaslané do tlače.

7.2 Prednášky a postery na konferenciách

Podstavková, S., Slivková, A., Miadoková, E., Vlček, D.: Genetic and molecular analysis of repair-deficient C. reinhardtii strains. Central European Countries DNA Repair Workshop, Smolenice, 1996, 47.

Vlček, D., Miadoková, E., Podstavková, S., Slivková, A.: DNA repair in Chlamydomonas reinhardtii. Central European Countries DNA Repair Workshop, Smolenice, 1996.

Vlček, D., Podstavková, S., Slivková, A., Miadoková, E.: Genetic and molecular analysis of non-excision DNA repair in Chlamydomonas reinhardtii. Abstracts of 7^th International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas, Regensburg, Germany, 27.5-1.6.1996, P-100.

Slivková, A., Podstavková, S., Miadoková E., Vlček, D.: Využitie vplyvu chemických a fyzikálnych mutagénov na zatriedenie UV-citlivých mutantov Chlamydomonas reinhardtii do reparačných dráh. Abstrakty Gen. konf. Ľudský genóm, Bratislava, 1996, Inf. listy, 18, str.23.

Vlček, D., Slivková, A., Podstavková, S., Miadoková, E.: Genetická a molekulárna analýza neexcíznej DNA reparácie u Chlamydomonas reinhardtii. Abstrakty Gen. konf. Ľudský genóm, Bratislava, 1996, Inf. listy, 18, str. 26.

Slivková, A., Podstavková, S., Miadoková, E., Vlček, D.: Charakteristika troch reparačne-defcitných mutantov Chlamydomonas reinhardtii. Konference mladých mikrobiologů - Tomáškovy dny 96, 5.-6. jún, 1996, Brno. Zborník str. 32-33, Scripta Medica (Brno) 69: 70-71.

Slivková, A., Miadoková, E., Podstavková, S., Vlček, D.: Responses of Chlamydomonas reinhardtii repair deficient strains to X-ray irradiation. International Symposium Biology and taxonomy of green algae III, Smolenice, 1997, Book of abstract, p 53.

Vlček, D., Podstavková, S., Slivková, A., Miadoková, E.: Analysis of UV-sensitive mutants of Chlamydomonas reinhardtii. International Symposium Biology and taxonomy of green algae III, Smolenice, 1997, Book of abstract, p 59.

Slivková, A., Gálová, E.: Response of C. reinhardtii repair deficient strains to various stress factors. International conference Molecular biology of plants under environmental stress, Poznaň, 1997, in Biol. Bull. of Poznaň 34 (Suppl.): p.92.

Vlček, D., Slivková, A., Podstavková, S., Miadoková, E., Vlčková, V.: Chlamydomonas reinhardtii as a model system for DNA repair study. Abstracts of 7^th International conference on Enviromental Mutagens, Toulouse, France, 7- 12 September 1997,, p.109, P-XIII-70

Slivková A., Vlček D., Podstavková S., Miadoková E.: Reparačné mechanizmy Chlamydomonas reinhardtii. Česko-slovenská genetická konferencia, Bratislava, 17.-18. 9. 1998, 45.

Slaninová M., Slivková A.: Štúdium analógie uvs11 mutanta Chlamydomonas reinhardtii a rad9 mutanta Saccharomyces cerevisiae v prepojení doležitých bunkových procesov. Česko-slovenská genetická konferencia, Bratislava, 17.-18. septembra 1998, str. 80.

Slaninová, M., Slivková, A.: uvs11 mutant of Chlamydomonas reinhardtii and rad9 mutant of Saccharomyces cerevisiae have analogous function in important cell processes. 27^th Annual Conference on yeasts. Smolenice. Abstract in Folia Microbiol., 1999, 44, 114-115.

Slaninová, M., Ševčovičová, A., Nagyová, B., Juhás, M., Farkašová, E., Vlček, D.: Effect of the cell cycle arrest on survival of the yeast Saccharomyces cerevisiae and green algae Chlamydomonas reinhardtii after influence with various mutagens. XXVIII. Annual Conference on Yeast, Smolenice, 2000, Abstract in Folia Microbiologica 45, 90, 2000.

Slaninová, M., Ševčovičová, A., Nagyová, B., Juhás, M., Farkašová, E., Vlček, D.: Comparison of the function of Chlamydomonas reinhardtii UVS11 gene with the function of Saccharomyces cerevisiae RAD9 gene. Ninth International Conference on the Cell and Molecular Biology of Chlamydomonas, Noordwijkerhout, Netherlands, May 21-26, 2000 - poster.

8. Summary

Chlamydomonas reinhardtii is a convenient model organism for DNA-repair systems studies in eukaryotic cells. It enables to study repair of both nuclear and extranuclear DNA. The study of Chlamydomonas DNA-repair systems has been less progressing in comparison to other eukaryotic microorganisms, such as yeast. For better understanding of Chlamydomonas reinhardtii DNA repair machinery, it is important to complete general phenotypical characteristics of repair-deficient mutant strains included in the existing collection of UV-sensitive mutants as a basic prerequisite for speeding up the study of repair mechanisms in algae.

Phenotypic characterization, genetic and molecular analysis of mutants were carried out. We have supplemented general characteristics with results obtained after MNNG treatment and X-ray irradiation. The most sensitive strain after MNNG and X-ray treatment was the strain uvs15, but this strain did not mutate after X-irradiation and there is very low mutation rate after MNNG treatment. Moreover, the deficiency in pyrimidine dimer excision was proved in this strain. The mutant with such properties (excision deficiency with no or very reduced level of mutability) has not been described in heterotrophic organisms so far. Strain uvsE1 with impaired recombinational repair pathway was also very sensitive to MNNG and X-ray damage. These results indicate a posible role of recombination repair pathway in coping with DNA damage caused by X-ray irradiation. Moreover, we observed increased frequencies of streptomycine-resistant mutations in uvsE1 mutant. It suggests that recombination repair is an error-free process. It was found that the strain uvs14 manifests higher levels of spontaneous and induced mutability (mutator phenotype). It indicates the posible role of this gene in a mismatch correction.

A UV-specific endonuclease was used to monitor the presence of UV-induced pyrimidine dimers according to Small and Greimann (1977). Molecular analysis of pyrimidine dimer excision from DNA of repair deficient strains revealed the deficiency in pyrimidine dimer excision in strain uvs12 and uvs15, whereas uvs13 and uvs14 are not blocked in removal of pyrimidine dimers.

Genetic analysis of excision-deficient group of mutants was carriad out. It revealed that this repair pathway is determinated by at least 5 genes.

The collection of C. reinhardtii repair-deficient mutants includes ones with possible impaired DNA damage-dependent cell cycle control. The effect of DNA damage on the progression of algal strain uvs11 through cell cycle has been investigated. Cells were arrested with methyl benzimidazole-2-yl-carbamate (MBC) and treated with UV, X-ray and MMS, respectively, and the MBC block was maintained to simulate a G2 delay response which is a common response of eukaryotic cells with damaged DNA. Repair of DNA lesions was monitored by cell viability. Our results indicate that the UVS11 gene could play a role in checkpoint control, e.g. blocks cell cycle progression if DNA is damaged. This suggestion is supported with the fact that survival of damaged cells in uvs11 is restored to nearly wild type level by artificially imposing a G2 block with MBC.

The developing the reliable nuclear transformation procedures of Chlamydomonas enables to clone genes by complementing stable mutations and to isolate and characterize of many genes with known phenotypic effects not only in the field of repair mechanisms. By using a method in which C. reinhardtii cells were agitated in the presence DNA, glass beads and polyethylene glycol, we achieved nuclear transformation rates of 0,12 x 10 ^-6 až 15,9 x 10 ^-6.