Úvod

1

1. Odpoveď bunky na pôsobenie faktorov prostredia s genotoxickým účinkom

4

1.1 Faktory prostredia s genotoxickým účinkom

4

1.1.1 UV žiarenie a jeho účinok na bunku

4

1.1.2 Ionizačné žiarenie a jeho účinok na bunku

7

1.1.3 Toxický a mutagénny účinok alkylačných zlúčenín

9

1.2 Mechanizmy opravy DNA poškodení

11

1.2.1 Reparačné mechanizmy priamo odstraňujúce poškodenie DNA

13

1.2.1.1 Fotoreaktivácia

13

1.2.1.2 Oprava spórových fotoproduktov

14

1.2.1.3 Oprava alkylovaných báz a alkylfosfotriesterov

14

1.2.1.4 Ligácia zlomov

16

1.2.2 Reparačné systémy opravujúce poškodenia DNA vo viacerých krokoch

16

1.2.2.1 Excízia poškodeného úseku

16

1.2.2.1.1 Bázová excízna oprava

17

1.2.2.1.2 Nukleotidová excízna oprava

19

1.2.2.1.3 Oprava chybne spárovaných báz („mismatch korekcia")...

23

1.2.2.2 Rekombinačná oprava

25

1.2.2.3 Syntéza DNA cez poškodenie - mutagénna oprava

28

1.3 Reparačné mechanizmy Chlamydomonas reinhardtii

31

1.4 Zastavenie bunkového cyklu ako odpoveď na poškodenie DNA

34

1.4.1 Úloha RAD9 génu

35

37

2. Transformácia jadrového genómu Chlamydomonas reinhardtii .

39

2.1 Selektívne markery

40

2.1.1 Markery komplementujúce mutácie Chlamydomonas reinhardtii

41

2.1.2 Markery nesúce rezistenciu na antibiotiká

42

2.2 Metódy na zavedenie DNA do jadrového genómu Chlamydomonas reinhardtii

42

2.2.1 Bombardovanie .

43

2.2.2 Elektroporácia

43

2.2.3 Transformácia pomocou sklených guličiek

43

3. Ciele dizertačnej práce

45

4. Materiál a metódy

47

4.1 Použité kmene

47

4.2 Kultivačné médiá

48

4.2.1 Médiá použité na kultiváciu rias

48

4.2.2 Médiá použité na kultiváciu kvasiniek Saccharomyces cerevisiae

52

4.2.3 Médiá použité na kultiváciu baktérií Escherichia coli

52

4.3 Použité mutagény

52

4.4 Rádioaktívne značené chemikálie

52

4.5 Plazmid použitý na transformáciu

53

4.6 Stanovenie prežívania a mutability reparačne-deficitných kmeňov Chlamydomonas reinhardtii po pôsobení UV-žiarenia, MMS a X-žiarenia

53

4.6.1 Príprava buniek na ovplyvňovanie mutagénmi

53

4.6.2 Zastavenie bunkového cyklu Chlamydomonas reinhardtii pomocou MBC

54

4.6.3 Ovplyvnenie buniek Chlamydomonas reinhardtii mutagénmi

54

4.6.4 Stanovenie prežívania

55

4.6.5 Stanovenie mutability

55

4.7 Stanovenie prežívania buniek Saccharomyces cerevisiae po pôsobení UV-žiarenia, MMS a X-žiarenia

56

4.7.1 Príprava buniek na ovplyvňovanie mutagénmi

56

4.7.2 Ovplyvnenie buniek Saccharomyces cerevisiae mutagénmi

56

4.8 Genetická analýza Chlamydomonas reinhardtii

57

4.8.1 Rekombinačná analýza

57

4.8.2 Analýza na úrovni zygót

58

4.9 Stanovenie excízie pyrimidínových dimérov po pôsobení UV žiarenia

58

4.10 Fluorescenčná mikroskopia

64

4.11 Transformácia buniek Chlamydomonas reinhardtii

64

4.11.1 Izolácia plazmidovej DNA z Escherichia coli

64

4.11.2 Štiepenie plazmidovej DNA reštrikčnou endonukleázou NcoI

65

4.11.3 Elektroforéza DNA

65

4.11.4 Izolácia autolyzínu

65

4.11.5 Odstránenie bunkovej steny Chlamydomonas reinhardtii pomocou autolyzínu

67

4.11.6 Transformácia buniek Chlamydomonas reinhardtii

67

5. Výsledky

68

5.1 Letálnehy a mutagénny účinok MNNG a X-žiarenia na reparačne deficitné kmene Chlamydomonas renhardtii

68

5.1.1 Prežívanie po pôsobení MNNG a X-žiarenia

68

5.1.2 Mutabilita po pôsobení MNNG a X-žiarenia

74

5.2 Vyštiepovania pyrimidínových dimérov pri reparačne-deficitných mutantov
Chlamydomonas reinhardtii

75

5.3 Genetická analýza

79

5.4 Vplyv mikrotubulového jedu metyl benzimidazol 2-yl-karbamátu na zastavenie bunkového cyklu riasy Chlamydomonas reinhardtii využitím fluorescenčnej mikroskopie

81

5.5 Prežívanie mutantného kmeňa rad9 Saccharomyces cerevisiae po pôsobení UV-žiarenia, X- žiarenia a MMS a sledovanie vplyvu MBC na zmenu prežívania

82

5.6 Prežívanie mutantného kmeňa uvs11 Chlamydomonas reinhardtii po pôsobení UV-žiarenia, X- žiarenia a MMS a sledovanie vplyvu MBC na zmenu prežívania

84

5.7 Transformácia jadrového genómu Chlamydomonas reinhardtii

89

5.7.1 Izolácia plazmidu pARG7.8

89

5.7.2 Hodnotenie účinnosti transformácie

89

6. Diskusia

92

7. Závery

107

8. Literatúra

110